超级光稳定的基于磷的染料,用于多采集激发发射耗尽成像
超级光稳定的基于磷的染料,用于多采集激发发射耗尽成像

王晨光,T正昌,佐藤喜胜,深泽爱子,东山哲也和山口繁广。 J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 10374–10381.

 

DOI:?/jacs.7b04418

 

抽象

由于激发发射耗尽(STED)显微镜可以提供具有超出衍射极限的光学分辨率的细胞结构细节,因此它已成为细胞生物学中必不可少的工具。但是,强烈的STED激光束通常会引起所用荧光染料的快速光漂白,从实际的角度来看,这大大限制了STED显微镜的应用。本文中,我们报告了一种新的超光稳定染料PhoxBright 430(PB430)的设计,该染料包括一个完全环稠合的π-共轭骨架和一个电子接受性磷脂。P-氧化单元。我们以前通过将磷脂单元与给电子三苯胺部分结合而开发了超光稳定染料C-Naphox。在PB430中,氨基的去除将分子类型从分子内电荷转移特征转变为π–π *转移特征,从而产生了对分子环境不敏感的强烈荧光,无论是荧光颜色还是强度,即使在水性介质中,荧光也很明亮。 PB430还具有在水中的高溶解度,并能够在保持高荧光量子产率的情况下标记蛋白质。这种染料即使在STED条件下也表现出出色的抗光辐射性,并可以连续采集STED图像。确实,使用PB430偶联抗体,我们成功实现了超分辨率STED图像的3-D重建以及荧光标记的细胞骨架结构的基于光稳定性的多色STED成像。

 

介绍

荧光纳米显微镜,特别是STED显微镜,越来越多地用于生物样品的可视化,以及各种物理和化学过程的检查。[1] 但是,必须用功率非常高的圆环形耗尽激光束(STED激光)照射样品(>从实际的角度来看,10 MW / cm2)严重限制了STED显微镜的应用。尽管已经进行了许多努力来提高染料的光阻,但是仍然强烈要求用于STED的高光阻荧光染料的出现。在本文中,山口教授 在名古屋大学已报告第二代超光稳定荧光染料PhoxBright 430的设计,[2] 表示为PB430。 PB430极大地扩展了此类荧光染料在STED纳米显微镜中的实用性。

 

?细节

图1显示了基于第一代超光稳定染料C-Naphox的合理结构修饰的PB430的分子设计。

 

图2显示了(a)C-Naphox,(b)的归一化吸收光谱(实线)和荧光光谱(虚线)。1和(c)2 在甲苯(蓝线)和CH中3CN(橙色线)。

 

Figure 3 shows the (a) absorption (solid line) and fluorescence (dashed line) spectra of PB430 in PBS buffer (pH 7.4) and (b) comparison of the photostability among Alexa Fluor 488, C-Naphox, and PB430. Absorption variation of DMSO/HEPES buffer solutions (pH = 7.3, v/v = 7/3) of Alexa Fluor 488 (blue triangles), C-Naphox (green squares), and PB430 (orange circles) were plotted as a function of irradiation time with a Xe lamp (9 mW cm–2) equipped with a band-pass filter of 460 ± 11 nm. Solution concentrations were adjusted to be comparable to one another in terms of optical density at 460 nm.

 

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图4显示了固定的HeLa细胞中免疫标记的微管的荧光图像:(a)共聚焦(左)和STED(中间)显微镜图像和强度分布(右)以及共聚焦插图中的虚线(黑线) )和STED(绿线)图像。 (b,c)用(b)PB430和(c)Alexa Fluor 488染色的前五个STED显微图像。(d)绘制的积分荧光强度与记录的STED图像数量的关系。在470 nm激发下记录所有图像,并使用592 nm的耗尽激光(CW-STED,30 mW)进行STED。比例尺指示2μm。

 

图5显示(a)用PB430免疫标记的HeLa细胞微管的3-D STED图像,包括与高度相对应的色标(增量为z方向,50 nm;比例尺,5μm)。在以下STED条件下记录图像:在470 nm处激发(WLL,5μW),在592 nm处耗尽(CW-STED,30 mW; STED 3Dz 甜甜圈(50%)和门控检测tg = 0.5 ns. Each image was deconvoluted using the Huygens Deconvolution Software (signal-to-noise ratio, 7; quality threshold, 0.05) and the z剖面图像被着色以代表z-深度。 (b)沿着对应的STED图像zz面板中的飞机

 

?参考

[1]”STED显微镜显示突触小泡胞吐后突触小分子仍然聚集。.”

威利格,我。 Rizzoli,S。O .;威斯特法尔,V。 R.Jahn;地狱,西南性质 2006, 440, 935?939.

DOI:?10.1038 /自然04592

[2]”A Phosphole Oxide Based Fluorescent Dye with Exceptional Resistance to Photobleaching: A Practical Tool for Continuous Imaging in STED Microscopy”

王昌; A.深泽;塔基佐藤东山山口市Angew。 Chem。,Int。埃德 2015, 54, 15213?15217.

DOI:?10.1002 / anie.201507939